化學發光免疫分析平臺

發光是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態（較低能級）躍遷到激發態（較高能級），然后在返回到基態并釋放光子的過程。根據形成激發態分子的能量來源不同發光可以分為光照發光、生物發光、化學發光。

化學發光（chemiluminescence，CL）是指伴隨化學反應過程所產生的光的發射現象。反應體系中的某些物質分子，如反應物、中間體或者熒光物質在進行化學反應時，由于吸收了反應時產生的化學能，使反應產物分子激發至激發態，受激分子由激發態回到基態時，便發出一定波長的光。化學發光分析方法主要是依據化學發光檢測體系中待測物濃度與體系的化學發光強度在一定條件下呈線性定量關系的原理，利用儀器對體系化學發光強度進行檢測，而確定待測物含量的一種痕量分析方法。

1977年，Halman等將化學發光與抗原抗體免疫反應相結合，創建了化學發光免疫分析方法（chemiluminescent immunoassay，CLIA），相較于傳統免疫技術（放射免疫技術、酶免疫技術、熒光免疫技術等），CLIA具有自動化程度高、特異性好、精確度高、檢測范圍廣等優勢。

化學發光免疫分析方法類型及其原理

CLIA包含兩個部分，即化學發光分析系統和免疫反應系統。化學發光分析系統是利用化學發光物質經催化劑的催化和氧化劑的氧化，形成一個激發態的中間體，當這種激發態中間體回到穩定的基態時，同時發射出光子(hν)利用發光信號測量儀器測量光量子產額。免疫反應系統是將發光物質(在反應劑激發下生成激發態中間體)直接標記在抗原或抗體上，或酶作用于發光底物。化學檢測系統通過光電信號檢測儀檢測發光強度，最后通過化學發光標記物與發光強度的關系確定被測物的含量。

CLIA根據標記物的不同可分為三大類，即直接化學發光免疫分析、酶促化學發光免疫分析和電化學發光免疫分析。

直接化學發光

化學發光劑直接標記抗體或抗原的免疫測定方法稱為化學發光免疫分析。直接化學發光劑在發光免疫分析過程中不需要酶的催化作用，直接參與發光反應，他們在化學結構上有產生發光的特有基團，可直接標記抗原或抗體，目前常見的直接化學發光標記物主要有吖啶酯類化學發光劑。

用吖啶酯直接標記抗體，與待測標本中相應的抗原發生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原-吖啶酯標記抗體復合物，這時只需加入氧化劑（H₂0₂）和NaOH使成堿性環境，吖啶酯即可在不需要催化劑的情況下分解、發光。由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內所產生的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從標準曲線上計算出待測抗原的含量。

直接化學發光速度快、試劑穩定性好，但靈敏度略低于酶促發光。

酶促化學發光

酶促化學發光免疫分析(chemiluminescentenzymeimmunoassay，CLELA)是以酶標記抗原或抗體進行免疫反應，免疫反應復合物上的酶再作用于發光底物，在信號試劑作用下發光，用發光信號測定儀進行發光測定，酶的濃度決定了化學發光的強度。辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)為化學發光酶免疫分析常用的標記酶，發光底物以魯米諾、AMPPD為代表。

魯米諾+HRP發光體系

HRP-CLEIA體系具有發光時間短(幾秒內瞬時閃光)，發光強度低、不易測量等缺點，為了解決這一問題，通常在發光系統中加入發光增強劑。發光增強劑主要作用為放大光輸出，增強光信號，提高發光持續性，從而提高分析靈敏度和可重復性。

該分析系統采用辣根過氧化物酶（HRP）標記抗體，在與反應體系中的待測標本和固相載體發生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶（HRP）標記抗體復合物，這時加入魯米諾發光劑、H₂O₂和化學發光增強劑使產生化學發光。

ALP+AMPPD發光體系

堿性磷酸酶(ALP)和1，2-二氧環己烷構成的發光體系是目前最重要、最靈敏的化學發光體系，其中最具代表性的是ALP-AMPPD發光體系。該反應體系以堿性磷酸酶標記抗體，在與反應體系中的待測標本和固相載體發生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標記抗體復合物，這時加入AMPPD發光劑，堿性磷酸酶使AMPPD脫去磷酸根基團而發光。

電化學發光免疫分析

在電極上施加一定的電壓或電流時，在電極電化學反應產物之間或電極反應產物與溶液中某種組分之間發生化學反應而產生激發態，當激發態躍遷回基態時放出能量，此過程即為電化學發光(electrochemiluminescence，ECL)。電化學發光免疫分析(electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA)是以電化學發光劑三聯吡啶釕標記抗體，以三丙胺(TPA)為電子供體，在電場中因電子轉移而發生特異性化學發光反應，它包括電化學和化學發光兩個過程。

在電化學發光免疫分析系統中，磁性微粒為固相載體包被抗體，用三聯吡啶釕標記抗體，在反應體系內待測標本與相應的抗體發生免疫反應后，形成磁性微粒包被抗體-待測抗原-三聯吡啶釕標記抗體復合物，這時將上述復合物吸入流動室，同時引入TPA緩沖液。當磁性微粒流經電極表面時，被安裝在電極下面的電磁鐵吸住，而未結合的標記抗體和標本被緩沖液沖走。與此同時電極加壓，啟動電化學發光反應，使三聯吡啶釕和TPA在電極表面進行電子轉移，產生電化學發光，光的強度與待測抗原濃度成正比。

三種化學發光免疫分析方法的比較

化學發光、時間分辨熒光、酶免疫分析對比

臨床應用

CLIA具有特異性強、靈敏度高、準確、操作簡單、快速等優點，它將化學分析方法和免疫學分析方法的優點融合了起來，已經被廣泛用于生命科學、環境科學、臨床醫學和生理學等領域。常見的臨床醫學應用有：

甲狀腺激素檢測；
生殖激素檢測；
垂體激素和皮質激素檢測；
貧血因子檢測；
腫瘤標志物檢測；
感染性標志物檢測；
感染性疾病；
糖尿病、胰島素、血清C-肽、血漿胰高糖素等；
心臟標志物檢測；
病毒標志物檢測；
過敏性疾病；
治療藥物檢測；

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