基于NGS的分子診斷

分子診斷是應用分子生物學方法，通過檢測受檢個體或其攜帶病毒、病原體的遺傳物質的結構或含量變化而做出診斷的技術，而基于下一代測序（Next Generation Sequencing，NGS）的分子診斷被廣泛應用于傳染性疾病、血液篩查、遺傳性疾病、腫瘤伴隨診斷等領域。相比于免疫診斷技術，NGS在發現未知基因、液體活檢方面具有優勢，但目前存在明顯局限性，如對基礎設施要求高、結果的準確性和可重復性存在問題等。

1. NGS概述

自Sanger測序后，NGS技術顯著發展，可提供更高的數據輸出、效率和應用。將DNA（或cDNA）隨機片段化、加接頭，制備測序文庫，通過對文庫中數以萬計的克隆進行延伸反應，檢測對應的信號，最終獲取序列信息。NGS在處理大規模樣品時具有顯著的優勢，成為目前組學研究的主要技術。

Fig.1 NGS基本流程

1.1 文庫制備

NGS的先決條件是高質量的文庫。文庫制備首先需獲得與測序所需分子相對應的模板，然后制備片段使其與所使用的測序平臺兼容。測序可分為DNA測序（DNA-Seq）和RNA測序（RNA-Seq）。文庫大小是由插入片段（接頭序列之間的文庫部分）大小決定的，最佳插入片段長度是由NGS設備以及特定測序應用決定的。

1.1.1 DNA文庫制備

根據測序模板，DNA-Seq可以包括全基因組測序（WGS）、全外顯子組測序（WES）、表觀基因組測序或靶向測序（TS）。模板制備包括聚合酶鏈式反應（PCR）和基于雜交捕獲的方法。

• PCR常用于制備TS模板。在早期階段，擴增子測序側重于有限數量的基因或外顯子（短程PCR）。長程PCR（LR-PCR）的出現使鳥槍測序（對隨機斷裂的、比擴增子短的片段進行測序）成為一種主要方法。因此，LR-PCR改善了短擴增子測序中出現的序列模糊問題。
• 雜交捕獲常用于制備WES和TS模板，其中互補的生物素化探針與目標區域雜交，使用鏈霉親和素包被的磁珠進行分離。與PCR相比，這種富集方法對于較大基因組區域是一種經濟高效的方法，同時減少了等位基因丟失。

DNA-Seq文庫構建涉及片段化、末端修復、接頭連接和大小選擇的核心步驟。DNA片段化將DNA剪切成最佳的特定尺寸范圍，三種斷裂方法包括物理（即超聲處理）、酶促（即斷裂酶或轉座酶破碎）或化學（二價金屬陽離子加熱）方法。較小的片段有助于高質量的測序數據，而較長的片段則提供遠端相位信息。

起始DNA被片段化后，會使用T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶以及Klenow片段三種酶的混合物進行末端補平和5'端磷酸化。3'端利用Taq DNA聚合酶或Klenow片段加A尾。片段化后產生5'/3'黏性末端及平末端，粘性末端都需轉化為平末端。在使用TA連接的方式進行接頭連接時，DNA片段在5'端磷酸化后使用Taq DNA聚合酶在3'端加“A”與帶“T”黏性末端的接頭互補配對。接頭連接后，PCR富集通常與文庫制備步驟相結合。PCR通常使用高保真聚合酶，該酶具有5'→3'聚合酶活性，可沿5'→3'方向合成DNA，同時具有的3'→5'核酸外切酶活性，可去除新合成的DNA鏈或引物3'端的不匹配堿基。

1.1.2 RNA-seq文庫制備

對于RNA文庫，需要根據測序目的進行文庫構建方案的篩選。如果目的是發現復雜全面的轉錄，文庫需要覆蓋整個轉錄組，包括編碼、非編碼、反義及基因間RNA。RNA-Seq對于功能基因組研究非常有用，例如差異基因表達、選擇性剪接和變異發現。RNA-Seq可分為全轉錄組測序（WTS）、mRNA測序（mRNA-Seq）和小RNA測序（smRNA-Seq）。樣品制備一般包括三個步驟：總RNA分離、靶RNA富集以及RNA反轉錄成互補DNA（cDNA）。

cDNA合成

RNA需經過反轉錄形成cDNA的第一條鏈，因RNA極易被環境中存在的RNase降解，在反轉錄過程中使用RNase Inhibitor可以抑制這些酶的活性，保護RNA不被RNase降解。與此同時，逆轉錄酶將模板RNA反轉錄成cDNA；逆轉錄酶具有依賴RNA的DNA聚合酶活性，能夠以RNA為模板，按5'→3'方向合成一條與RNA模板互補的DNA單鏈，也就是cDNA第一鏈。

cDNA第二鏈合成時，RNase除去RNA-DNA雜交鏈中的RNA鏈，配合DNA聚合酶催化合成。DNA聚合酶具有5'→3'DNA聚合酶活性，可在模板和引物的作用下，沿5'→3'方向合成與cDNA一鏈互補的序列。隨后進行末端修復、接頭連接、PCR擴增最終產生cDNA文庫。

2. NGS的臨床應用

隨著精準醫療概念的提出，臨床應用上對NGS的需求越來越大，病原學診斷、檢測與遺傳病、腫瘤等疾病的精準診斷等應用領域對NGS的要求也越來越高。在發生的幾次世界性范圍的傳染性疫情中，NGS技術也逐漸扮演起重要的角色。

2.1 臨床微生物病原學診斷

人體中有著由細菌、真菌、病毒等微生物組成的龐大而復雜的胃腸道系統，且人體許多疾病的發生都與微生物系統的失調或微生物入侵有著極其緊密的關系，而NGS技術的出現為這些微生物菌群的鑒定檢測與研究提供了有力的技術支持。

2.2 臨床微生物耐藥診斷

臨床上，醫院獲得性感染的細菌用藥治療一直是醫療難點，主要是由于在長期的抗生物用藥篩選中，許多病原體通過基因突變獲得對不同抗生素的耐藥性，給臨床治療造成了極大影響。目前，通過高通量測序深度挖掘并組建藥學相關微生物組學數據庫，根據數據庫發現超過60種藥物與微生物之間存在相互作用。后期高通量測序也可持續挖掘微生物耐藥性、微生物與藥物間相互作用及其與人類遺傳變異的相關性。

2.3 臨床腫瘤診治

在癌癥預防上，高通量測序平臺可以用于腫瘤基因的突變篩查，指導癌癥的防控工作；在癌癥治療上，通過高通量測序平臺挖掘與癌癥相關的基因，不僅可以發掘與癌癥相關的診斷靶標，還可以發掘與之相關的治療靶點，為臨床提供具體的個性化用藥指導。

2.4 遺傳疾病診斷檢測

NGS的另一項較為重要的應用是遺傳性疾病的檢測診斷，主要包括遺傳病診斷、產前篩查與診斷及植入性胚胎遺傳學診斷。對產婦進行無創產前基因檢測（NIPT），然后對基因檢測異常的產婦羊水或臍帶血細胞進行染色體Ｇ顯帶檢測和熒光原位雜交檢測，作為確診標準。NGS為遺傳性疾病診斷、新生兒疾病早期診斷、產婦無創檢測都提供了極大的便利，在遺傳性疾病的治療與預防方面呈現出很大的臨床應用價值。

表1. NGS平臺的臨床應用

參考文獻

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